PCR技術(shù)是一種在體外模擬DNA復(fù)制過(guò)程的核酸擴(kuò)增技術(shù)。它主要是重復(fù)三個(gè)循環(huán)：高溫變性、低溫退火和延伸，然后將目標(biāo)DNA擴(kuò)增數(shù)百萬(wàn)倍。 因此，PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度極高。但每一枚硬幣都有兩個(gè)面，PCR技術(shù)最大的缺點(diǎn)是非常容易被污染，極少量的污染就會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性。

一旦發(fā)生實(shí)驗(yàn)室核酸污染，必須停止正常的實(shí)驗(yàn)。然后需要大量的物力和人力資源，直到找到污染源，或者實(shí)驗(yàn)室的清潔度達(dá)標(biāo)。 此外，實(shí)驗(yàn)報(bào)告必須作廢。結(jié)果只有在重新實(shí)驗(yàn)后才可靠。

為了有效避免污染，獲得穩(wěn)定可靠的檢測(cè)結(jié)果，我們?cè)趯?shí)際工作中往往需要采取一定的措施來(lái)預(yù)防或消除污染。

污染源：

• 試劑污染

由于試劑容器、容器、水和其他溶液在制備 PCR 試劑的過(guò)程中會(huì)被核酸污染。

• 設(shè)備污染

半自動(dòng)核酸提取器和全自動(dòng)核酸提取器在提取過(guò)程中會(huì)導(dǎo)致樣本或核酸模板溢出，污染機(jī)器。或者設(shè)備內(nèi)的垃圾桶清洗不徹底，殘留液體或結(jié)晶揮發(fā)形成氣溶膠，進(jìn)而產(chǎn)生污染。

• 標(biāo)本交叉污染

造成標(biāo)本交叉污染的原因有多種：標(biāo)本采集容器被污染；標(biāo)本放置時(shí)因密封不良而溢出容器；標(biāo)本粘在容器外； 吸入器的污染和空氣中的氣溶膠。特別是，病毒可以通過(guò)氣溶膠或通過(guò)形成氣溶膠擴(kuò)散，造成相互污染。

• PCR產(chǎn)物污染

這是 PCR 中最常見的污染問(wèn)題。常見于擴(kuò)增后需要打開或擴(kuò)增后產(chǎn)物處理不當(dāng)?shù)臋z測(cè)。因?yàn)?PCR 產(chǎn)物的拷貝大小遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于 PCR 檢測(cè)的幾個(gè)拷貝的最大值。 因此，極少量的 PCR 產(chǎn)物污染可以形成假陽(yáng)性。

• 克隆質(zhì)粒污染

陽(yáng)性參考常用于實(shí)驗(yàn)室操作，而這些陽(yáng)性參考大多來(lái)自某些克隆質(zhì)粒。單位體積中克隆質(zhì)粒的濃度很高，使用不慎極易被污染。

一些實(shí)驗(yàn)室自行克隆質(zhì)粒作為質(zhì)控品。但是，經(jīng)過(guò)制備后，垃圾的處理方法不夠嚴(yán)格，導(dǎo)致質(zhì)控品對(duì)實(shí)驗(yàn)室的污染，進(jìn)而對(duì)標(biāo)本造成污染。

控制污染的措施

• 實(shí)驗(yàn)區(qū)劃

合理分隔實(shí)驗(yàn)室。分區(qū)或分區(qū)操作以下步驟：標(biāo)本處理、PCR反應(yīng)液制備、PCR循環(huán)擴(kuò)增、PCR產(chǎn)物鑒定等。 此外，應(yīng)特別注意標(biāo)本處理和PCR產(chǎn)物鑒定必須與其他步驟分開。

最好劃分為：標(biāo)本處理區(qū)、PCR反應(yīng)液制備區(qū)、PCR循環(huán)擴(kuò)增區(qū)、PCR產(chǎn)物鑒定區(qū)。并且他們的實(shí)驗(yàn)用品和吸氣器應(yīng)該專門使用。

實(shí)驗(yàn)室使用的紫外線應(yīng)在實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行滅菌，以破壞殘留的 DNA 或 RNA。

• 各區(qū)文章不得混用

各實(shí)驗(yàn)區(qū)應(yīng)用醒目的顏色清楚地標(biāo)明不同的設(shè)備和物品，避免不同工作區(qū)域的設(shè)備和物品混在一起。例如，各個(gè)區(qū)域?qū)ｉT使用的工作服、工作鞋、垃圾桶、拖把、抹布、鋼筆等。

使用一次性移液器吸頭、離心管、無(wú)塵手套、口罩等。

• 建立標(biāo)準(zhǔn)的空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)

盡可能使用全送全排空調(diào)系統(tǒng)空調(diào)系統(tǒng)。在進(jìn)入各個(gè)操作區(qū)的過(guò)程中，需要嚴(yán)格的單一流向，即試劑制備和儲(chǔ)存區(qū)→樣品制備區(qū)→PCR擴(kuò)增區(qū)→擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)，不能逆行。

• 污染監(jiān)測(cè)

采取以下措施進(jìn)行污染監(jiān)測(cè)：建立陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照、重復(fù)試驗(yàn)、選擇不同區(qū)域的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增等，從而采取預(yù)防和消除污染的措施。

• 定期實(shí)驗(yàn)室清潔

準(zhǔn)備含0.5%有效氯的消毒液擦拭設(shè)備表面、臺(tái)面、地板、物品表面、通行箱、門窗，并浸泡設(shè)備內(nèi)的垃圾桶。

酒精對(duì)空氣噴涂是按照自上而下、由內(nèi)而外的原理進(jìn)行的。

用酒精 (75%) 擦拭移液器、八管離心機(jī)、混合搖床和其他小型設(shè)備。

用純凈水擦拭設(shè)備表面、臺(tái)面和地板，并用純凈水沖洗設(shè)備廢罐。