流式細(xì)胞術(shù)是一種用于檢測(cè)和測(cè)量細(xì)胞或顆粒群的物理和化學(xué)特征的技術(shù)。 在此過(guò)程中，含有細(xì)胞或顆粒的樣品懸浮在液體中并注入 流式細(xì)胞儀  儀器中。 

流式細(xì)胞術(shù)的目的是什么？ 

流式細(xì)胞術(shù)提供了一種成熟的方法來(lái)識(shí)別溶液中的細(xì)胞，最常用于評(píng)估外周血、骨髓和其他體液。 流式細(xì)胞術(shù)研究用于識(shí)別和量化免疫細(xì)胞并表征血液惡性腫瘤。  他們可以測(cè)量： 

• 細(xì)胞大小
• 細(xì)胞粒度
• 總DNA 
• 新合成的 
• DNA基因表達(dá)
• 表面受體
• 細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)
• 瞬態(tài)信號(hào)

在非?？斓臅r(shí)間跨度內(nèi)執(zhí)行這些測(cè)量的能力是流式細(xì)胞術(shù)過(guò)程的關(guān)鍵優(yōu)勢(shì)之一。 它們可以在不到一分鐘的時(shí)間內(nèi)對(duì)單個(gè)樣品中的多達(dá)三到六種特性或成分進(jìn)行定量，逐個(gè)細(xì)胞地定量大約 10,000 個(gè)細(xì)胞。

流式細(xì)胞術(shù)儀器和方法

流式細(xì)胞儀吸入單分散的單個(gè)、未成團(tuán)的細(xì)胞懸浮液，一次一個(gè)（單列）通過(guò)激光束，其中每個(gè)細(xì)胞都穿過(guò)激光束、散射光和熒光，然后進(jìn)行計(jì)數(shù)和分類(lèi)或進(jìn)一步表征。 

流式細(xì)胞儀的三個(gè)主要組件是流體、光學(xué)和電子器件。

• 流式細(xì)胞儀的流體系統(tǒng)負(fù)責(zé)將樣品從樣品管輸送到流動(dòng)池，經(jīng)過(guò)激光、分類(lèi)和/或丟棄。
• 光學(xué)系統(tǒng)的組件包括激發(fā)光源、透鏡和濾光片，用于收集和移動(dòng)儀器周?chē)墓獠ㄩL(zhǎng)以及產(chǎn)生光電流的檢測(cè)系統(tǒng)。 數(shù)據(jù)中波長(zhǎng)響應(yīng)的差異有助于分析細(xì)胞類(lèi)型。
• 電子或流式細(xì)胞儀儀器。

使用流式細(xì)胞術(shù)的主要原理之一是能夠分析完整的細(xì)胞周期并分析不同階段的 DNA 含量。 監(jiān)測(cè)細(xì)胞周期的自然事件可以為疾病診斷和治療預(yù)后提供信息。細(xì)胞周期的不同階段可以揭示 DNA 含量的改變和其他異常，表明腫瘤的存在或晚期細(xì)胞死亡的跡象。 數(shù)據(jù)表達(dá)式通過(guò)與分析期間所選儀器使用相關(guān)的專(zhuān)用流式細(xì)胞術(shù)軟件存儲(chǔ)在計(jì)算機(jī)中。  流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)通常以兩種不同的方式報(bào)告： 直方圖和/或點(diǎn)圖 。

流式細(xì)胞儀

熒光激活 細(xì)胞分選 (FACS) 是一種特殊類(lèi)型的流式細(xì)胞術(shù)。它提供了一種根據(jù)每個(gè)細(xì)胞的特定光散射和熒光特性將生物細(xì)胞的異質(zhì)混合物分選到兩個(gè)或多個(gè)容器中的方法，一次一個(gè)細(xì)胞。 它與流式細(xì)胞術(shù)的不同之處在于，它提供獨(dú)特的表征，而不是僅僅對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)和分選。這兩種原理通常在共同表征類(lèi)型的過(guò)程中發(fā)揮作用，為流式細(xì)胞術(shù)分析提供完整的定性和定量方法。 

流式細(xì)胞術(shù)過(guò)程：  

細(xì)胞懸浮液被夾帶在狹窄、快速流動(dòng)的液體流的中心。 流動(dòng)的安排使得細(xì)胞之間相對(duì)于其直徑有較大的間隔。振動(dòng)機(jī)制迫使細(xì)胞流分裂成單個(gè)液滴。系統(tǒng)經(jīng)過(guò)調(diào)整，每個(gè)液滴出現(xiàn)多個(gè)細(xì)胞的可能性較低。 就在液流分解成液滴之前，液流通過(guò)熒光測(cè)量站，在該測(cè)量站測(cè)量每個(gè)細(xì)胞的感興趣的熒光特征。 

充電環(huán)正好放置在水流分裂成液滴的位置。 根據(jù)之前的熒光強(qiáng)度測(cè)量，將電荷放置在環(huán)上，當(dāng)液滴從流中破裂時(shí)，相反的電荷被捕獲在液滴上。然后帶電的液滴落入靜電偏轉(zhuǎn)系統(tǒng)，靜電偏轉(zhuǎn)系統(tǒng)根據(jù)液滴的電荷將液滴轉(zhuǎn)移到容器中。 在一些系統(tǒng)中，電荷直接施加到流上，并且分裂的液滴保留與流相同符號(hào)的電荷。 液滴分裂后，水流恢復(fù)到中性。

針對(duì)特定細(xì)胞表面蛋白的特異性抗體與熒光分子結(jié)合，然后添加到細(xì)胞混合物中。 下一步是熒光過(guò)程，而特定細(xì)胞通過(guò)激光束進(jìn)行監(jiān)測(cè)。根據(jù)細(xì)胞是否 具有 熒光標(biāo)記抗體，包含單個(gè)細(xì)胞的液滴被分配正電荷或負(fù)電荷。 然后通過(guò)電場(chǎng)檢測(cè)含有單個(gè)細(xì)胞的液滴，并根據(jù)其電荷轉(zhuǎn)移到單獨(dú)的收集管中， 從而可以輕松分離用熒光抗體標(biāo)記的細(xì)胞 。

多色流式細(xì)胞儀 

在檢查混合細(xì)胞群（例如人類(lèi)和動(dòng)物樣本中的血液和組織細(xì)胞）時(shí)，多色流式細(xì)胞術(shù)是一種有用的技術(shù)。 一般來(lái)說(shuō)，特定的細(xì)胞類(lèi)型用熒光染料（標(biāo)記物）標(biāo)記，例如熒光團(tuán)或碘化丙啶。 同時(shí)使用多種熒光標(biāo)記的能力可以識(shí)別多種細(xì)胞類(lèi)型，以及進(jìn)一步表征每個(gè)樣品的功能標(biāo)記。 有專(zhuān)門(mén)的儀器能夠測(cè)量 12 種以上的顏色 3,4 。 這些熒光染料和標(biāo)記物通過(guò)激光發(fā)射的不同波長(zhǎng)的光進(jìn)行測(cè)量，以根據(jù)單個(gè)細(xì)胞類(lèi)型進(jìn)行分類(lèi)。 每個(gè)標(biāo)記在特定波長(zhǎng)的光下被激發(fā)，以便在使用多個(gè)標(biāo)記時(shí)區(qū)分它們。

將典型的染色面板從 4 到 6 種顏色調(diào)整為超過(guò) 12 種顏色并不是簡(jiǎn)單的“即插即用”問(wèn)題，必須以系統(tǒng)的方式進(jìn)行處理，才能在染色面板中實(shí)現(xiàn)成功的參數(shù)。 面板設(shè)計(jì)的基本原理最好基于使用前的研究。換句話說(shuō)，即使從參考染色指數(shù)的開(kāi)始過(guò)程起，準(zhǔn)備工作就很關(guān)鍵，以便通過(guò)亮度 ⁵ 有效匹配熒光染料。

流式細(xì)胞儀提示：  在設(shè)計(jì)一抗面板之前，請(qǐng)花一些時(shí)間了解流式細(xì)胞儀的細(xì)微差別   。 重點(diǎn)關(guān)注可以在系統(tǒng)上進(jìn)行最敏感測(cè)量的位置。這個(gè)故事不僅僅是熒光強(qiáng)度。 考慮替換亮度較低的熒光染料以避免通道錯(cuò)誤。 

流式細(xì)胞術(shù)方法的常見(jiàn)應(yīng)用

流式細(xì)胞術(shù)是多個(gè)臨床領(lǐng)域不可或缺的組成部分，包括診斷、治療計(jì)劃和全身性疾病（無(wú)論是靜態(tài)的還是進(jìn)行性的）。 隨著我們對(duì)流式細(xì)胞術(shù)實(shí)際應(yīng)用的了解越來(lái)越多，知識(shí)庫(kù)也進(jìn)一步擴(kuò)大。 現(xiàn)在，研究人員比以往任何時(shí)候都對(duì)能夠更多地了解某些疾病和病癥的復(fù)雜性感到非常興奮。它導(dǎo)致診斷模式發(fā)生迅速變化，并徹底改變了治療癌癥等疾病的醫(yī)療方法   。

流式細(xì)胞術(shù)方法通常涉及其他綜合測(cè)試模式，例如形態(tài)學(xué)檢查。 在許多情況下，血液腫瘤描述了特定的形態(tài)變化，而流式細(xì)胞術(shù)提供了更大的特異性，并幫助病理學(xué)家擴(kuò)大組織異常或其他晚期疾病的范圍。在某些情況下，流式細(xì)胞術(shù)可以在檢測(cè)到形態(tài)變化之前預(yù)先確定癌癥的復(fù)發(fā) 。

現(xiàn)代臨床環(huán)境中治療和研究導(dǎo)向的一些主要應(yīng)用包括： 

• 蛋白質(zhì)表達(dá)——整個(gè)細(xì)胞，甚至細(xì)胞核
• 蛋白質(zhì)翻譯后修飾——包括切割和磷酸化的蛋白質(zhì)
• RNA——包括 miRNA 和 mRNA 轉(zhuǎn)錄物
• 細(xì)胞健康狀態(tài)——檢測(cè)細(xì)胞凋亡或細(xì)胞死亡
• 細(xì)胞周期狀態(tài)——提供強(qiáng)大的工具來(lái)評(píng)估 G0/G1 期細(xì)胞與 S 期、G2 或多倍體細(xì)胞，包括細(xì)胞增殖和激活分析
• 異質(zhì)樣品中不同細(xì)胞亞群的識(shí)別和表征，包括區(qū)分中央效應(yīng)記憶細(xì)胞與耗盡的 T 細(xì)胞或調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞

流式細(xì)胞術(shù)的基本原理在過(guò)去十年中幾乎沒(méi)有變化，但該技術(shù)的應(yīng)用卻發(fā)生了很大的變化。 流式細(xì)胞術(shù)的基礎(chǔ)與其主要功能是一致的，即當(dāng)細(xì)胞移動(dòng)經(jīng)過(guò)一組固定檢測(cè)器時(shí)，用激光詢問(wèn)流中的單個(gè)細(xì)胞或顆粒。細(xì)胞計(jì)數(shù)器越來(lái)越多地檢測(cè)到更多顏色的熒光，同時(shí)具有高速分選和分析功能 ⁸ 。

流式細(xì)胞術(shù)在分子科學(xué)研究中發(fā)揮著不可或缺的作用，并持續(xù)快速發(fā)展。  市場(chǎng)上有多種商用流式細(xì)胞儀。 它們往往遵循相同的基本原理，但在設(shè)計(jì)以及對(duì)齊和集成其他組件的概念方面存在重要差異。