細胞培養(yǎng)是生物科學(xué)體外研究不可或缺的一部分。它涉及在人工環(huán)境中培養(yǎng)永生化細胞系或原代細胞樣本。這些細胞可用作一系列不同科學(xué)研究的模型，包括測定藥物或其他化合物對生長、活力和新陳代謝的影響，或用作不同疾病的模型。它們通常用于進行體內(nèi)實驗之前的初步研究。

從細胞培養(yǎng)實驗中得出的結(jié)論的有用性和適用性在很大程度上取決于所進行的質(zhì)量控制 (QC)。適當?shù)?QC 可以確保細胞系模型給出可重復(fù)的結(jié)果，并可以自信地得出結(jié)論。忽略細胞培養(yǎng)中的 QC 可能會使研究人員和實驗室在時間和金錢方面付出巨大的代價，并且來自無法證明適當 QC 的實驗室的數(shù)據(jù)不太可能被公布。

Nikoleta Daskoulidou 博士是位于卡迪夫的英國癡呆癥研究所的研究員，致力于了解先天免疫在阿爾茨海默病中的作用。作為她工作的一部分，Daskoulidou 博士使用干細胞技術(shù)作為細胞模型。她描述了 QC 在她的研究中的重要性：“我認為不良的 QC 是缺乏可重復(fù)性和可能無效的研究數(shù)據(jù)的主要原因。對我來說，測試我正在使用的細胞的特性、純度和表型是非常重要的?！?Daskoulidou 博士提到了她在研究中使用的一些 QC 方法，包括“檢查特定標記的表達（和表達水平）以及檢測是否存在潛在的三體性”。這對于她研究阿爾茨海默病編碼序列變體的研究尤為重要。

本文將概述細胞培養(yǎng)中 QC 的四個主要方面，并描述它們是什么以及我們應(yīng)該執(zhí)行它們的原因。

你的細胞系是你認為的那樣嗎？

這聽起來像是一個顯而易見的問題，但不幸的是，作為研究人員，我們不能認為這是理所當然的。由于多種原因，可以使用以下細胞：1）來自不同器官；例如，肺與胃腸道，2) 來自不同的癌癥類型，3) 來自不同的生物體，例如小鼠上皮細胞與人類上皮細胞。此外，近年來，CRISPR 革命意味著存在大量經(jīng)過編輯的細胞系，必須密切注意確保親代細胞系保持分離。在錯誤的細胞系上進行實驗的影響是巨大的。體外工作是一個有缺陷但非常有用的模型系統(tǒng)，用于預(yù)測體內(nèi)效果. 例如，如果在藥物篩選過程中使用了錯誤識別的細胞系，則結(jié)果對進一步實驗的適用性就會受到影響。如果將不適當?shù)幕衔镉糜隗w內(nèi)研究，這可能會浪費資源并且還具有潛在的危險。根據(jù)Clara Forrer Charlier 博士的說法，來自里約熱內(nèi)盧大學(xué)的博士后研究員，STR 分型“對于結(jié)果的可重復(fù)性非常重要，是方法驗證和藥物發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)?！?目前正在研究 DNA 損傷反應(yīng)和基因組不穩(wěn)定性對神經(jīng)發(fā)育和神經(jīng)變性的影響的 Forrer Charlier 博士指出，STR 分型雖然非常重要，但在實驗室和她的實驗室中通?！白龅帽葢?yīng)該做的頻率低”，她確?！霸谑盏郊毎岛蟛⒃诙啻蝹鞔蠖ㄆ谶M行”。

據(jù)報道，在所有培養(yǎng)物中，不同細胞系的污染發(fā)生率約為 20%。當細胞系具有相似的表型（例如形態(tài)和生長速率）時，細胞識別問題會更加嚴重。確定您正在培養(yǎng)或接受的確切細胞類型的主要方法是 STR 分型。STR 分型利用包括不同個體人類在內(nèi)的生物體之間 DNA 的微小差異。力量; 短串聯(lián)重復(fù)，發(fā)生在基因組中，是包含串聯(lián)重復(fù)的非編碼 DNA 的一部分。該區(qū)域的 DNA 復(fù)制錯誤導(dǎo)致子 DNA 鏈的重復(fù)次數(shù)增加或減少。在群體水平上，這會導(dǎo)致 STR 基因座上出現(xiàn)許多不同數(shù)量的串聯(lián)重復(fù)。

STR 分型檢查不同 STR 基因座的重復(fù)數(shù)。商業(yè) STR 試劑盒檢查 16-23 個基因座，然后將其與參考數(shù)據(jù)庫進行比較，以確定被測細胞系的身份。匹配的可能性極低，大約為 1 x 10 18 個個體中的 1 個。

STR 分型的最新進展包括在整個基因組中包含更多基因座，多達 27 個，改進基因組區(qū)域的直接擴增以及更快的 PCR 循環(huán)能力，這可以減少處理時間。盡管如此，對于細胞系鑒定，該測定放大了牙釉蛋白基因和 17 個位點。STR 分型應(yīng)用的黃金標準由幾家不同的公司執(zhí)行，它們符合 ISO 9001 和 ISO/IEC 17025 質(zhì)量標準。

污染預(yù)防和篩查

除了確保您的細胞類型如您所想之外，保持細胞培養(yǎng)物不受污染是 QC 的另一個方面。這對于確?？芍貜?fù)和可靠的結(jié)果至關(guān)重要。最常發(fā)生的細胞培養(yǎng)污染來自細菌、真菌和支原體。Daskoulidou 博士在她的實驗室的實踐包括“每隔幾周檢查細胞系中潛在的支原體污染”。這對于支原體來說尤其重要，因為它不能被顯微鏡下的眼睛看到，因此可能很長一段時間都無法檢測到。

利用防止污染的措施以及篩選將最大限度地減少這對實驗的負面影響。預(yù)防方法包括使用良好的細胞培養(yǎng)實踐，包括在層流罩中工作，對所用的試劑、塑料器皿和玻璃器皿進行消毒，所有這些都可以將污染風(fēng)險降至最低。

篩查包括目測細胞生長培養(yǎng)基顏色，定期對培養(yǎng)中的細胞進行顯微鏡檢查，對于用顯微鏡無法看到的支原體，應(yīng)定期對細胞培養(yǎng)物進行檢測。最常見的支原體檢測方法包括微生物培養(yǎng)、熒光染料 DNA 染色和 PCR 以檢測支原體 rRNA 分子。

您是否正確處理您的細胞培養(yǎng)物？

一旦我們確定我們的細胞正是我們認為的那樣，并且它們沒有微生物污染，QC 的另一個方面就是我們在實驗室中培養(yǎng)細胞時維護它們的方式。

細胞傳統(tǒng)上在一次性塑料瓶中生長；將一定數(shù)量的細胞放入燒瓶和生長培養(yǎng)基中。

根據(jù)細胞系的生長速度，3-5 天后，細胞需要傳代；一些去除并添加新鮮的生長培養(yǎng)基。當這已經(jīng)重復(fù)了很多次（精確的數(shù)字取決于細胞類型），但通常是 15-30 倍時，細胞應(yīng)該被丟棄，另一批解凍。Daskoulidou 博士評論說，在研究干細胞等特定細胞類型時，就她的誘導(dǎo)多能干細胞研究而言，“我確保我使用低傳代細胞?！?

利用這些 QC 方法增加了細胞對不同條件和實驗做出一致反應(yīng)的可能性。未能定期傳代細胞會導(dǎo)致過度匯合，即對于燒瓶中的給定區(qū)域或生長培養(yǎng)基的量而言，細胞過多。這會影響生長速度和新陳代謝，這意味著在進行實驗時，細胞可能會做出不同的反應(yīng)。使用具有非常高的傳代數(shù)的細胞可能意味著細胞已耗盡、經(jīng)歷衰老、已開始分化或特定亞群生長得更多并主導(dǎo)培養(yǎng)。

除了這些 QC 實踐之外，還可以對細胞進行一些檢查，例如：蛋白質(zhì)表達、生長速率、活力、形態(tài)。如果其中任何一個發(fā)生改變，則應(yīng)丟棄細胞，并解凍較低的通道小瓶。

您是否適當?shù)貎Υ婧头窒砟募毎囵B(yǎng)物？

除了在生長過程中維持細胞外，細胞系儲存和轉(zhuǎn)移的質(zhì)量控制也是必不可少的。這可以分為三個需要 QC 的關(guān)鍵部分：1) 冷凍和解凍過程，2) 儲存，3) 文檔。

當不培養(yǎng)細胞時，標準的儲存方法是儲存在液氮氣相中的冷凍管中。

1 ) 應(yīng)使用正確的冷凍培養(yǎng)基（含 5-10% 二甲基亞砜 (DMSO) 的胎牛血清 (FBS)），并且冷凍應(yīng)緩慢進行。這可以保護細胞免受晶體形成。相比之下，必須在水浴中快速解凍，細胞迅速轉(zhuǎn)移到不含 DMSO 的培養(yǎng)基中，以避免 DMSO 造成的損害。

2) 儲存的質(zhì)量控制包括對液氮罐進行適當維護，定期重新填充和檢查罐密封，以確保恒溫和安全。良好的做法是在不同位置存放幾個小瓶，以確保在一個罐子受損時不會丟失整個庫存。公司或研究機構(gòu)內(nèi)的細胞系轉(zhuǎn)移也可能發(fā)生，尤其是在合作期間。確保細胞活力不受影響的適當包裝和轉(zhuǎn)移方法是關(guān)鍵。

3) 對于存儲和轉(zhuǎn)移，以及使用標準化協(xié)議，QC 必須標記和記錄。如果沒有這些，最終可能會得到不是我們認為的那樣的細胞，如上所述浪費時間和金錢。Forrer Charlier 博士指出了解您正在冷凍的東西的身份的重要性，并評論說“如果您計劃冷凍細胞庫，也建議使用 STR 分型?！?適當?shù)臉擞洶ㄊ褂靡韵陆M合標記單個細胞冷凍管：彩色蓋子、貼紙或冷凍安全標記筆，表示細胞系、接收日期、傳代數(shù)和可能已進行的任何更改或基因編輯。

您使用的試劑是否標準化？

細胞系可能會受到它們?nèi)缟纤龅呐囵B(yǎng)和儲存方式以及所使用的試劑的影響。最重要的試劑是細胞培養(yǎng)基和用于培養(yǎng)細胞的血清。

不同的細胞系或細胞類型需要具有不同成分的細胞培養(yǎng)基，但它們通常包括葡萄糖、鹽、維生素、氨基酸和許多其他營養(yǎng)素。此外，還需要某種類型的血清，通常是 FBS。

這些試劑成分的差異會改變細胞系的生長速率、活力和其他特征，因此對此進行 QC 是必不可少的。細胞培養(yǎng)基本身很容易標準化；有許多不同的公司生產(chǎn)和銷售媒體，并將進行自己的測試和滅菌。實驗室和研究所也可以在內(nèi)部制備培養(yǎng)基。對于細胞培養(yǎng)基的制造商和供應(yīng)商，將對每批生產(chǎn)的產(chǎn)品進行一系列標準化測試，包括篩查常見污染物。供應(yīng)商將提供一份分析證書，說明培養(yǎng)基無污染，并且是根據(jù)具有設(shè)定制造協(xié)議的配方生產(chǎn)的。

FBS 不是制造的，而是收獲的。因此，批次之間的差異更大，因此需要進行更多測試以確保重現(xiàn)性和質(zhì)量控制。FBS 測試的一個關(guān)鍵部分是確定細胞在不同批次培養(yǎng)時的行為是否存在差異。出于這個原因，最好使用一個批次進行一整套實驗。  

最終用戶測試不同批次的培養(yǎng)基以識別細胞表型的任何變異性很重要，因為不同的細胞類型對配方中的最小變化具有不同的敏感性。該領(lǐng)域的最新發(fā)展包括更深入地檢查細胞行為以響應(yīng)培養(yǎng)條件，包括基因組篩選、細胞蛋白質(zhì)組檢查和代謝組學(xué)變化的鑒定。

質(zhì)量控制一直是并且仍然是良好細胞培養(yǎng)實踐的基礎(chǔ)。它最大限度地減少了實驗之間的可變性，并增強了生成結(jié)果的穩(wěn)健性。此外，隨著頻率的增加，出版期刊需要研究中的 QC 證明才能發(fā)表來自給定實驗室的論文。細胞系鑒定和鑒定、污染篩查、適當?shù)募毎囵B(yǎng)實踐、儲存和使用標準化試劑都是應(yīng)該定期進行的 QC 的重要方面。許多進行質(zhì)量控制的技術(shù)早已確立，但如上所述，有許多新的發(fā)展，包括用于 STR 分型和支原體篩選的快速實驗室內(nèi)檢測試劑盒，跟蹤儲存細胞系的軟件以及樣本和可訪問的組學(xué)篩選工具，以便隨著時間的推移或?qū)π略噭┑姆磻?yīng)對細胞進行更深入的評估。這些新技術(shù)可以實現(xiàn)更準確的細胞質(zhì)量檢查或增加將 QC 納入常規(guī)實驗室實踐的便利性。