貼壁細(xì)胞通常在平面表面上培養(yǎng)，例如由細(xì)胞培養(yǎng)皿或燒瓶提供的表面。通過培養(yǎng)基進(jìn)行氣體和營(yíng)養(yǎng)交換，因此必須徹底優(yōu)化條件以支持細(xì)胞生長(zhǎng)。貼壁細(xì)胞培養(yǎng)固有的問題包括附著不良、產(chǎn)量或活力受損，以及產(chǎn)生不均勻的細(xì)胞單層，這些問題在細(xì)胞擴(kuò)增過程中會(huì)變得更加明顯。本文重點(diǎn)介紹了這些問題的一些常見原因，并提供了在常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)和放大過程中預(yù)防這些問題的有用建議。

貼壁細(xì)胞培養(yǎng)的挑戰(zhàn)

貼壁細(xì)胞培養(yǎng)的一個(gè)主要挑戰(zhàn)在于讓細(xì)胞附著在培養(yǎng)容器上。這在低血清或無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)尤其成問題，因?yàn)榧?xì)胞粘附和擴(kuò)散通常需要血清中的附著蛋白（玻連蛋白和纖連蛋白）。另一個(gè)問題是確保為細(xì)胞提供足夠的氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，以避免損害活力或引發(fā)可能在下游進(jìn)一步造成問題的表型變化。細(xì)胞單層均勻分布也很重要。均勻分布不僅促進(jìn)一致的細(xì)胞生長(zhǎng)，而且還最大限度地增加了可以從培養(yǎng)容器中收獲的細(xì)胞數(shù)量。

預(yù)防常見的生長(zhǎng)問題

通過采用貼壁細(xì)胞培養(yǎng)的最佳實(shí)踐，可以輕松克服剛剛描述的挑戰(zhàn)?？梢酝ㄟ^允許細(xì)胞多次傳代以適應(yīng)血清減少或無血清條件或使用具有特殊處理表面的培養(yǎng)容器來促進(jìn)附著。應(yīng)仔細(xì)選擇有效的涂層，包括聚-L-賴氨酸、明膠、膠原蛋白和各種專有配方，以適應(yīng)細(xì)胞類型。通過預(yù)熱和預(yù)充氣使培養(yǎng)基達(dá)到正確的 pH 值也有助于細(xì)胞更快地粘附，并且在使用較大的培養(yǎng)容器時(shí)特別有益。

由于容器大小和培養(yǎng)基體積會(huì)對(duì)氣體交換和氧氣輸送到貼壁細(xì)胞產(chǎn)生重大影響，因此必須仔細(xì)優(yōu)化培養(yǎng)基高度。培養(yǎng)基高度應(yīng)足夠低，以使氧氣從頂部空間自由流動(dòng)到細(xì)胞，但又應(yīng)足夠高，以提供足夠的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)來支持健康的細(xì)胞生長(zhǎng)。通常建議使用每 cm 2生長(zhǎng)面積 0.2–0.4 mL 生長(zhǎng)培養(yǎng)基進(jìn)行貼壁細(xì)胞培養(yǎng)。

為避免產(chǎn)生不均勻的單層，細(xì)胞接種物應(yīng)在添加到培養(yǎng)容器后與培養(yǎng)基進(jìn)行充分而溫和的混合。這可以通過小心地左右傾斜培養(yǎng)皿或使用大口徑血清移液管執(zhí)行幾個(gè)緩慢的抽吸和分配步驟來實(shí)現(xiàn)。在生物安全柜和培養(yǎng)箱之間更換培養(yǎng)基或移動(dòng)培養(yǎng)物時(shí)，避免產(chǎn)生剪切力也很重要。當(dāng)培養(yǎng)基掃過細(xì)胞時(shí)會(huì)發(fā)生剪切，導(dǎo)致部分單層分離。溫和的處理技術(shù)消除了這些問題，還可以幫助防止氣泡的形成，這些氣泡可以阻止新鮮接種的細(xì)胞粘附或?qū)е乱呀?jīng)附著的細(xì)胞壞死。

應(yīng)用最佳實(shí)踐來擴(kuò)大規(guī)模

研究人員擴(kuò)大貼壁細(xì)胞培養(yǎng)的原因有很多。這些包括產(chǎn)生用于免疫測(cè)定應(yīng)用（如蛋白質(zhì)印跡或 ELISA）的細(xì)胞裂解物，在單克隆抗體開發(fā)過程中擴(kuò)增產(chǎn)生抗體的克隆，以及生產(chǎn)各種細(xì)胞療法。無論最終目標(biāo)如何，擴(kuò)大規(guī)模都要求隨著船舶規(guī)模的增加保持一致的增長(zhǎng)；這是確保細(xì)胞特征不改變的關(guān)鍵。

典型的放大操作可能會(huì)將細(xì)胞從多孔板、細(xì)胞培養(yǎng)皿、燒瓶中取出，最終在多層燒瓶中生長(zhǎng)。后者旨在在不占用 CO 2培養(yǎng)箱中過多空間的情況下最大限度地提高產(chǎn)量，并且現(xiàn)在可以使用允許在與傳統(tǒng) 175 cm2 燒瓶共享相同占地面積的容器中培養(yǎng)多達(dá)十層貼壁細(xì)胞的模型。其中包括 Falcon ?細(xì)胞培養(yǎng)多功能培養(yǎng)瓶（提供 525 cm 2和 875 cm 2）和 Corning ? HYPERFlask ?細(xì)胞培養(yǎng)容器（1720 cm2）。對(duì)于更大的放大容量，其他選項(xiàng)包括滾瓶（最大 1,750 cm2）、Corning ?CellSTACK ?培養(yǎng)室（最大 25,440 平方厘米），以及可連接到生物反應(yīng)器的高度復(fù)雜的封閉灌注系統(tǒng)（最大 85,000 平方厘米）。

重要的是要記住，較小的容器可以在放大之前徹底優(yōu)化培養(yǎng)條件。例如，多孔板或培養(yǎng)皿可用于比較不同的培養(yǎng)基配方，或在細(xì)胞在燒瓶等較大容器中生長(zhǎng)之前確定最佳接種濃度。培養(yǎng)基體積應(yīng)在整個(gè)擴(kuò)增過程中保持恒定（mL 培養(yǎng)基/cm2），以避免引入可能在更大范圍內(nèi)產(chǎn)生更顯著影響的變異性。

除了單層和多層燒瓶外，永岳醫(yī)療還提供各種用于貼壁細(xì)胞培養(yǎng)的容器，包括96孔板和培養(yǎng)皿。要了解更多信息，請(qǐng) 點(diǎn)擊此處