什么是細(xì)胞培養(yǎng)？

細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞培養(yǎng)是指在自然環(huán)境之外的受控條件下培養(yǎng)細(xì)胞的過程。 它是一種 體外 工具，有助于了解細(xì)胞生物學(xué)和疾病機(jī)制。它還在藥物發(fā)現(xiàn)中發(fā)揮作用，例如藥物毒性測試和藥代動力學(xué)/藥效學(xué)研究，以及個性化醫(yī)療。

美國胚胎學(xué)家羅斯格蘭維爾哈里森在 20 世紀(jì)初開發(fā)了第一個體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，當(dāng)時他成功地從體外的青蛙胚胎中培養(yǎng)出組織碎片。 今天，細(xì)胞培養(yǎng)已經(jīng)幫助了無數(shù)的發(fā)現(xiàn)，例如針對脊髓灰質(zhì)炎、麻疹、腮腺炎和其他傳染病的疫苗的開發(fā)。

粘附與懸浮培養(yǎng)

細(xì)胞生長有兩種基本系統(tǒng)：貼壁培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)。貼壁培養(yǎng)物在人造基質(zhì)上生長，而懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞在培養(yǎng)基中自由漂浮。雖然只有少數(shù)細(xì)胞類型在懸浮液中自然生長（例如淋巴細(xì)胞），但許多貼壁細(xì)胞類型可以適應(yīng)懸浮培養(yǎng)。

在懸浮液中培養(yǎng)天然貼壁細(xì)胞有兩個原因。懸浮培養(yǎng)的第一個優(yōu)點是細(xì)胞更容易傳 代，因為您不需要通過酶解或機(jī)械解離將它們從培養(yǎng)容器中分離出來。其次，懸浮培養(yǎng)更容易擴(kuò)大規(guī)模，因為細(xì)胞生長僅受其在培養(yǎng)基中的濃度限制，而不是受可用表面積限制。懸浮培養(yǎng)的主要缺點是它們需要每日細(xì)胞計數(shù)和活力測定來遵循生長模式，而貼壁培養(yǎng)可以在顯微鏡下輕松檢查。

2D 與 3D 方法

貼壁培養(yǎng)可進(jìn)一步分為 2D 和 3D 培養(yǎng)。在 2D 應(yīng)用中，貼壁細(xì)胞在平面上以單層系統(tǒng)生長，例如在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。

由于其簡單性，2D 技術(shù)無法模擬細(xì)胞的體內(nèi)環(huán)境，它們通常在具有復(fù)雜細(xì)胞間相互作用的三維結(jié)構(gòu)中生長。這就是為什么一些實驗是使用 3D 培養(yǎng)物進(jìn)行的，這些培養(yǎng)物可以使用基于支架或無支架的技術(shù)進(jìn)行培養(yǎng)。

基于支架的 3D 方法通常涉及在水凝膠支架中生長貼壁細(xì)胞。生物陶瓷、金屬或聚合物支架等替代品也用于某些應(yīng)用。

無支架技術(shù)用于通過三種不同方法之一來生長球體：

強制浮動：將細(xì)胞懸液裝入涂有低粘附性聚合物的微孔板的孔中。然后將微孔板離心以迫使細(xì)胞形成球狀體。

懸滴：將細(xì)胞懸液裝入懸滴板的孔中。顧名思義，懸浮液將以液滴形式懸掛在盤子上。細(xì)胞將聚集在這些液滴的尖端并形成球體。

基于攪拌：將細(xì)胞懸浮液置于旋轉(zhuǎn)的生物反應(yīng)器中。由于不斷的攪拌，細(xì)胞不能粘附在壁上，因此形成了球狀體。

細(xì)胞培養(yǎng)挑戰(zhàn)

盡管方法和技術(shù)不同，但所有實驗都有一個共同點：很難以所需數(shù)量培養(yǎng)活細(xì)胞以獲得可重復(fù)的結(jié)果。因此，以下部分將專門討論四大挑戰(zhàn)——可重復(fù)性、污染、可行性和向自動化的過渡。

再現(xiàn)性

根據(jù) 永岳醫(yī)療 的一項調(diào)查，超過 70% 的科學(xué)家報告說他們未能重現(xiàn)另一位科學(xué)家的實驗，超過一半的人未能重現(xiàn)他們自己的工作。在細(xì)胞培養(yǎng)分析中，大部分重現(xiàn)性問題來自細(xì)胞傳代或代際之間的生物學(xué)差異。另一個大問題是細(xì)胞系的錯誤識別，而培養(yǎng)參數(shù)的不一致也起著重要作用。

生物變異

每次細(xì)胞分裂時，隨機(jī)突變或轉(zhuǎn)錄錯誤等因素都有可能影響實驗的可重復(fù)性。為避免這種情況，您應(yīng)該在新項目開始時創(chuàng)建一個細(xì)胞庫。

細(xì)胞銀行

細(xì)胞庫是指存儲多批特定細(xì)胞類型以供以后使用的過程，以避免影響可重復(fù)性的隨機(jī)突變或轉(zhuǎn)錄錯誤等因素。第一步是建立一個主細(xì)胞庫 (MBC)，方法是在培養(yǎng)物中培養(yǎng)選擇的感興趣的細(xì)胞類型，并將其冷凍保存在多個容器中。MBC 批次解凍并用于稍后制備工作細(xì)胞庫 (WBC)。

細(xì)胞系的錯誤識別

自 1960 年代以來，細(xì)胞系錯誤識別問題就為人所知，當(dāng)時一位科學(xué)家描述了 19 種其他人類細(xì)胞系的 HeLa 細(xì)胞污染。為確保您的結(jié)果可靠，更重要的是，確保您不會得出錯誤的結(jié)論，您應(yīng)該將所有進(jìn)入實驗室的新細(xì)胞系進(jìn)行隔離，直到其來源得到驗證。最重要的是，建議在冷凍保存和分發(fā)給其他實驗室之前以及項目完成后重復(fù)細(xì)胞系認(rèn)證。要驗證細(xì)胞系，您應(yīng)該首先檢查它是否在錯誤識別細(xì)胞系登記冊中列出. 如果沒有注冊，您仍然需要確認(rèn)其真實性。對于人類細(xì)胞系，建議進(jìn)行短串聯(lián)重復(fù) (STR) 分析（DNA 指紋）。多種測試方法可用于非人類細(xì)胞系，包括核型分析、同工酶分析和線粒體 DNA 分型（DNA 條形碼）。

培養(yǎng)參數(shù)

第三個影響重現(xiàn)性的因素是培養(yǎng)參數(shù)。

例如，氧氣水平會顯著影響培養(yǎng)的細(xì)胞。然而，影響氧合的變量，例如培養(yǎng)室規(guī)格或細(xì)胞密度，并不總是記錄在案，因此無法保持一致。

另一個重要的培養(yǎng)參數(shù)是培養(yǎng)基。這提供了必要的營養(yǎng)物質(zhì)、生長因子和激素，并調(diào)節(jié)了 pH 值和滲透壓。因此，最重要的是其組成始終相同。這對于補充了胎牛血清 (FBS) 的培養(yǎng)基配方尤為苛刻，其成分取決于奶牛的飲食、地理位置和一年中的時間等因素。為了盡量減少 FBS 對結(jié)果重現(xiàn)性的影響，您應(yīng)該在當(dāng)前庫存開始不足時訂購不同批次的血清，并對其進(jìn)行測試以找到最接近的匹配。為了讓其他人重現(xiàn)您的結(jié)果，您應(yīng)該報告您如何篩選血清，并記錄批號。

細(xì)胞處理

大多數(shù)研究人員都知道培養(yǎng)參數(shù)對其應(yīng)用有巨大影響，但處理技術(shù)的變化往往被忽視。

污染

當(dāng)細(xì)胞從組織中分離出來并在實驗室培養(yǎng)時，它們不再受到免疫系統(tǒng)的保護(hù)，因此極易受到污染。

第一個污染源是非生物污染物，例如培養(yǎng)基、血清、補充劑或水中的雜質(zhì)，以及內(nèi)毒素和可浸出物。預(yù)防措施包括使用實驗室級水進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)實驗，以及提供內(nèi)毒素檢測認(rèn)證的制造商提供的培養(yǎng)基、血清、補充劑和消耗品。此外，耗材必須由純聚苯乙烯或聚丙烯制成，以確保塑料添加劑不會滲入您的細(xì)胞培養(yǎng)物中。

第二個污染源是生物污染物，例如細(xì)菌（包括支原體）、真菌和酵母菌。

可行性

細(xì)胞活力定義為樣品中活細(xì)胞的比例。除了我們剛剛看到的污染物之外，還有其他各種影響細(xì)胞活力的因素。環(huán)境條件——溫度、pH、滲透壓、養(yǎng)分供應(yīng)以及O 2和CO 2濃度——非常重要。這些變量中的大多數(shù)由培養(yǎng)基控制，并且是特定于細(xì)胞類型的，不幸的是，這意味著我們無法提供具體的指導(dǎo)方針。

由于細(xì)胞對壓力非常敏感，因此您不僅要注意環(huán)境條件，還要注意您的液體處理技術(shù)。

影響細(xì)胞活力的最后一個因素是衰老。大多數(shù)有限細(xì)胞系在死亡前可以存活 20 到 60 次分裂，這意味著它們只能在 15 到 45 代之間重復(fù)使用。之后，需要從細(xì)胞庫中解凍冷凍保存的樣本。連續(xù)細(xì)胞系可以無限增殖，但由于它們?nèi)菀装l(fā)生遺傳漂變，因此應(yīng)定期更換。

使用比色法、熒光法和生物發(fā)光法的檢測分析可用于測量細(xì)胞活力。一種常用的比色法是 MTT 法，它基于活細(xì)胞將黃色四唑鹽還原為紫色甲臜晶體。

自動化

上述許多挑戰(zhàn)可以通過自動化細(xì)胞培養(yǎng)工作流程來解決。例如，細(xì)胞處理將始終保持一致，對重現(xiàn)性和活力產(chǎn)生積極影響。最重要的是，自動化降低了用戶污染的風(fēng)險。

盡管有這些優(yōu)勢，但由于預(yù)算原因、機(jī)器人沒有空間，或者因為沒有足夠的資源來一次自動化和驗證每個步驟，自動化整個工作流程可能具有挑戰(zhàn)性。但這可以解決！

我們希望我們能夠回答您關(guān)于細(xì)胞培養(yǎng)的所有問題，并且您現(xiàn)在對使用快樂細(xì)胞進(jìn)行可重復(fù)的實驗更有信心。